BL10U2

P2生物防护蛋白晶体学光束线站
科学目标
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  P2生物防护蛋白质晶体学线站是上海光源线站工程16条光束线站之一。该线站设计定位为具有生物安全防护水平二级的晶体衍射数据采集实验室,通过晶体衍射方法进行病毒结构与功能研究。该线站将支撑科研人员对病原微生物(如病毒等)的整体颗粒以及转录复制复合体的结构和功能进行研究,阐明病原微生物侵染宿主细胞、以及进行转录复制的分子机制,用于开发全新、高效、特异的检测手段、疫苗和治疗性的药物。

线站布局图
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线站指标
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 项目   设计指标  验收指标  实测值
 光子能量范围   7~18 keV  7~18 keV  6.5~18.1 keV
 能量分辨率   2×10-4  2×10-4  (1.78±0.02)×10-4
 样品处光通量(@12.7keV,300mA)   2×1012 phs/s  1×1012 phs/s  (2.52±0.01)×1012 phs/s
 聚焦光斑尺寸(@12.7keV)   20.0×10.0 m2  30.0×15.0 m2  (16.8±0.1)×(9.4±0.6) m2
 光束线发散角(@12.7keV)   1.5×0.2 mrad2  2.0×0.5 mrad2  (0.411±0.003)×(0.187±0.006) mrad2
 P2生物安全防护功能   具备  具备  具备
 样品筛选速度   >15 个/小时  >15 个/小时  34 个/小时
 最高分辨率   ≤0.800 Å  ≤0.800 Å  0.673 Å
实验站
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P2 生物防护蛋白质晶体学线站(BL10U2)配置了高性能的面探测器(Eiger X 16M),自研了同时具备垂直衍射仪和原位衍射仪的双衍射仪,以及全新设计的上样机械手。
  图1 实验站构成图
(1)探测器
  P2 生物防护蛋白质晶体学线站(BL10U2)配置的面探测器型号为Eiger X 16M,目前各主要数据处理软件(包括iMosflm,XDS,DIAL、autoPX和HKL2000等)均直接支持Eiger X 16M的实验数据,数据处理前不需要解压缩。不同于传统的探测器,Eiger探测器收集的原始衍射数据的文件不是每张衍射图一个文件,而是使用了一种称为HDF5的文件格式。HDF5是一种流行的且开源的储存科学数据的容器格式。目前被广泛使用在包括人工智能和自由电子激光等研究领域。Eiger X 16M输出的HDF5文件,有两种类型,分别为master文件和data文件。其中,master文件主要保存元数据,类似于image header,但提供的信息量要多得多,也可以保存少量原始衍射数据;data文件保存原始衍射数据。查看衍射图或数据处理的时候,只需要打开master文件就可以访问整套数据(Adxv除外,Adxv是需要打开data文件的)。
  表1 探测器指标参数
Eiger X 16M探测器
 像素尺寸   75×75 µm2
 像素数量   4150×4371
 有效面积  311.2×327.8 mm2
 最大速度  1 mm/s
 探测器-样品点移动距离范围  135-800 mm
 读出帧频  133 Hz(全幅)
750 Hz(4 M)
 最高分辨率  0.685 Å
 
(2)自研双衍射仪
  实验站建设期间克服辐射防护与生物安全共存的科学需求带来的工程难度,自主设计开发了支持常规模式和原位数据采集的双衍射仪,能够在不同实验模式间快速切换。
 图2 原位数据收集图  
  图3 传统旋转数据收集图
(3)自研机械手
  全新设计的上样机械手具有容量大、换样速度快、故障处理简洁的特点。晶体换样机械手包括三部分:大容量样品杜瓦、高稳定性机械手夹具与用户友好的机械手控制软件。该机械手换样速度为20秒,样品容量大于500个,抓手干燥时间小于40秒,具备图像辅助定位功能与样品二维码识别功能,能实现每小时多于15颗样品的筛选速度。
  
  图4 自动换样机械手设计图(A.实物图 B.整体组成示意图 C. 新型样品杜瓦设计图 D. 新型机械手夹具设计图)
数据采集与处理
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P2生物防护蛋白质晶体学线站有两种运行模式,一种是常规模式(同BL02U1),另一种是二级生物防护模式。在P2生物防护蛋白质晶体学线站上,可以利用以下多种实验方法开展生物大分子或者病毒颗粒晶体结构研究:
  • 多波长反常散射法(MAD)
  • 单波长反常散射法(SAD)
  • 同晶置换(MIR)
  • Shutter-less数据采集
  • 原位衍射
  • 分子置换(MR)
  • 传染性病毒晶体衍射实验(BSL-2级别)
  • 其它单波长实验方法
同时线站还提供多种数据采集方法及数据自动处理软件:
1. Helix晶体衍射数据采集方法
  方法原理
  一般情况下,P2生物防护蛋白质晶体学线站(BL10U2)在样品点的光斑尺寸为20×10 µm2(FWHM),样品处光通量为2×1012phs/s(@12.7 keV, 300 mA)。由于光斑尺寸较小,样品处光密度较高,在单个位置收集的旋转数据仅利用晶体体积的一小部分,并且辐射损伤较强。为了将总剂量分散,可以在每个采样点旋转结束后平移到下一个采样点进行采样,这种策略称为“Helix晶体衍射数据采集方法”。
  对于辐照敏感及晶体尺寸允许的实验条件,推荐用户使用“Helix晶体衍射数据采集方法”开展实验,以降低辐射损伤,获得更好的实验结果。在Helix晶体衍射数据采集方法中,用户将在晶体中选择若干个点,每个位点之间都添加了一个小的平移,因此对于每个位点,晶体都会移动以暴露新的部分,从而收集到更为高质量的数据。
  性能指标
  (1)衍射仪参数
  Helix晶体衍射数据采集方法需要光束位置稳定性和高精度力学支撑,以在扫描晶体长度时实现平稳移动。衍射仪平移和转动阶段中的任何机械粗糙度、摆动或扭曲都会导致轻微的晶体错位,容易影响最终数据质量的图像集成。
  为了提高数据采集效率及质量,本线站配置一台高精度、高转速的测角仪,可以沿转轴方向平移,以便将晶体移到X光束里。在转轴顶端需有两维位移台,用于将晶体样品移至转轴上。测角仪各个方向移动的精度达到0.5微米,满足小尺寸晶体的需求。
  (2)数据获取和处理
  在P2生物防护蛋白质晶体学线站,采用Finback系统进行Helix晶体衍射数据采集方法的参数设置与数据收集。目前支持一套数据30 个points,单张图0.025 秒的采样频率。
  图1 Finback数据收集软件界面
图2 Helix设置界面
优势:使用Helix晶体衍射数据采集方法优势一是分散辐射总剂量,降低辐射损伤;二是由于每个位点之间晶体都会移动以暴露新的部分,从而收集到更为高质量的数据。
应用领域:该方法将支撑科研人员对易受辐射损伤晶体的衍射数据收集与结构解析。
典型实验结果
图3 采样起点和采样终点的选择
  图4 参数设置
  图5 采样过程
  图6 在线数据还原结果
  
2.P2防护下的原位晶体衍射数据采集
方法原理
  大分子结晶学(Macromolecular crystallography,MX)是用于确定生物大分子的结构的主要方法。大分子的结构信息也为病毒相关研究做出了重要贡献。在同步辐射光束线站中研究病原微生物的结构时,必须在兼容的生物安全基础设施下进行操作。P2生物防护蛋白质晶体学线站(BL10U2)是具有生物安全防护水平二级的晶体衍射数据采集实验室,通过晶体衍射方法进行病毒结构与功能研究。
  在BL10U2,实验人员将使用“P2防护下的原位晶体衍射数据采集”方法开展实验。在该方法中,传染性的样品被封装在晶体板中运输至实验站,晶体板被固定在衍射仪上直接进行衍射实验。通过衍射仪的平动与转动,收集晶体板中多颗晶体的衍射数据,数据拼接之后进行数据的还原和重建。
  
  图7 原位晶体衍射
性能指标
  (1)实验站布局
  P2实验站的总体布局图见图8。实验站将处于BSL-2级的生物安全防护之下,可以进行需要BSL-2级环境下进行的病毒颗粒晶体样品实验。实验站共分为5个区域。核心区域是实验棚屋,内部配置高精度衍射仪、快速探测器、自动上样机器手以及原位衍射设备。从实验棚屋向右分别是样品准备、缓冲间、更衣室及控制区域。缓冲间、样品准备间及实验棚屋对实验大厅保持负压。
  图8 P2实验站布局
  本线站已取得上海市病原微生物实验室备案凭证,可以满足凭证中P2级别病原微生物的操作项目。见图9。
  图9 上海市病原微生物实验室备案凭证
(2)数据获取和处理
  在P2生物防护蛋白质晶体学线站,采用Finback系统进行数据采集。采用Porpoise进行在线数据还原。
  图10 Finback数据收集软件界面
  图11 Porpoise数据在线还原界面
(3)结晶板的运动
  为了实现原位蛋白质晶体衍射数据采集,实验站配置一台可以夹持结晶板的衍射仪,两套衍射仪可以根据用户实验进行切换。
(4)快速探测器
  探测器的性能对生物大分子晶体学实验站的性能影响非常大,直接决定了数据采集的方式。P2生物防护蛋白质晶体学线站采用波荡器作为光源,在样品点的光强很高,可以用很短的曝光时间来采集数据。采用快速面探测器可以提高数据的采集速度,同时还可以采用无快门的数据采集方式,避免了由于快门与旋转轴之间不同步带来的系统误差,提高数据准确性。P2生物防护蛋白质晶体学线站使用一台Dectris公司生产的Eiger X 16M探测器,支持快速grid scan:
  
3.自动数据处理系统
  在自主开发的全新的数据采集软件系统Finback完成数据收集后,自动运行自主整合的数据处理软件Seal,将每一套数据使用5种不同的pipeline(XDS、DIALS、xia2(3dii)、xia2(dials))、autoPROC(XDS))同时进行数据还原,并判断反常散射信号。对于有反常散射信号的数据,自动进行SAD相位解析获得晶体结构。开发并部署数据信息网站。用户可以直接访问网站查看数据处理结果。用户数据云存储于上海光源数据中心,并自行拷贝。  
  图12 数据处理结果
图13 SAD相位解析获得晶体结构